Untersuchungen von inter- und intramolekularen Interaktionen des globalen Regulators AbrB und dessen Antirepressors AbbA

Abstract

Aus den frühen Bindungsstudien des globalen Regulators AbrB mit der ausgedehnten phyC-Promotorregion von Bacillus amyloliquefaciens FZB45 konnte ein mehrstufiger kooperativer Bindungsprozess abgeleitet werden. Dabei verlangt die AbrB-vermittelte Repression von phyC nach Integrität zweier großer Bindungsstellen, ABS1 und ABS2, die 162 bp voneinander entfernt liegen. In der vorliegenden Arbeit wurden die ersten Echtzeitkinetiken zur DNA-AbrB-Interaktion mittels der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) gemessen und analysiert. AbrB zeigte hohe Affinitäten zu den 40 bp langen Oligonukleotiden, die den beiden Bindungsstellen entstammen. Dabei verursachten alle Oligonukleotide der ABS2 und nur eine kurze Region innerhalb der ABS1 bei der Bindung von AbrB Konformationsänderungen im Protein und in der DNA (CD - Zirkulardichroismusspektroskopie) und wiesen eine Kooperativität von 2<nHill<4 mit einer Stöchiometrie von zwei DNA zu einem AbrB-Tetramer auf (SPR). Mittels chemischer Interferenzfootprints wurden Thymine und Guanine als starke AbrB-Kontaktstellen bestimmt, die hauptsächlich auf einer Seite der DNA-Helix lagen. In dieser Arbeit wurde weiterhin die Funktion des AbrB-Antirepressors, AbbA, genauer untersucht. AbbA verdrängt konzentrationsabhängig den Transkriptionsrepressor AbrB von der phyC-DNA (EMSA), wobei DNA und AbbA um dieselbe Bindungsstelle im AbrB-Tetramer konkurrieren (CD). Aus den Bindungskinetiken von AbrB und AbbA konnte eine negative Kooperativität abgeleitet werden (SPR). Ferner wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die C-terminalen Domänen von AbrB mehrere Funktionen besitzen. In Abwesenheit des C-Terminus zeigte AbrB keine kooperativen Effekte, weder bei der Bindung an DNA noch an AbbA. Die C-terminalen Substitutionsmutanten von AbrB zeigten im Vergleich zum WT-AbrB veränderte DNA-bindende Aktivität. Im Rahmen der Arbeit gelang es zudem, einen Einblick über die Größe und Form des AbrB-Tetramers mittels Röntgenkleinwinkelstreuung zu erhalten.

Abstract

In previous binding studies it could be demonstrated that a global regulator AbrB and the extensive phyC promoter region of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 interact in a complex manner. AbrB binding is a multistep cooperative process. The integrity of both binding sites, ABS1 and ABS2, which are separated by 162 bp, is crucial for the AbrB-mediated repression of phyC. This work presents the first real-time binding kinetics of the AbrB-DNA interaction using surface plasmon resonance (SPR). AbrB exhibited high affinities to all analyzed 40-bp oligonucleotides that were derived from the ABSs of phyC. All parts of the ABS2, but only a small region within ABS1, were bound cooperatively to AbrB with a stoichiometry of 2 DNA to 1 AbrB tetramer and with 2<nHill<4 (SPR) inducing conformational changes of the protein and DNA (CD - circular dichroism spectroscopy). Using chemical interference footprints, mainly thymines and guanines contacting AbrB were primarily determined at one face of the DNA-helix. This work presents also an extensive analysis of the AbrB antirepressor AbbA. Addition of AbbA to the AbrB-phyC complex resulted in the release of DNA in a concentration-dependent manner (EMSA). Furthermore DNA and AbbA compete for the same binding site of AbrB tetramer (CD). The AbrB-AbbA binding kinetics indicated a negative cooperativity. Moreover, in the present work it could be demonstrated that the C-terminal domains of AbrB exhibit multiple functions. In the absence of the C-termini AbrB showed no cooperative behaviour neither in binding with DNA nor with AbbA. AbrB proteins with substitutions within the C-terminus resulted in altered DNA binding activity when compared to native AbrB. This work presents the first insight into the size and shape of AbrB tetramer using small angle X-ray scattering (SAXS).